生物醫(yī)學(xué)交叉研究院張二荃實(shí)驗(yàn)室證明調(diào)控晝夜節(jié)律的核心組分RUVBL2是真核生物鐘的共同起源分子
清華新聞網(wǎng)3月27日電 晝夜節(jié)律廣泛存在于地球上的生物體中，是生物體預(yù)知并響應(yīng)環(huán)境的晝夜變化的重要機(jī)制。晝夜節(jié)律在維持生理穩(wěn)態(tài)和人體健康中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其紊亂可能引發(fā)睡眠障礙、肥胖、免疫力下降等疾病，并增加癌癥及精神疾病的風(fēng)險(xiǎn)，對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。
生物鐘是晝夜節(jié)律的分子機(jī)制，以轉(zhuǎn)錄-翻譯負(fù)反饋環(huán)路（transcription–translation feedback loop,TTFL）的形式發(fā)揮功能。TTFL模型是20世紀(jì)90年代提出的，目前在不同生物鐘系統(tǒng)中得到了廣泛應(yīng)用。然而，隨著研究的深入，TTFL理論面臨諸多挑戰(zhàn)。
3月26日，清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院張二荃實(shí)驗(yàn)室在《自然》（Nature）發(fā)表題為“p環(huán)NTPase RUVBL2是真核生物中保守的時(shí)鐘成分”（The P-loop NTPase RUVBL2 is a conserved clock component across eukaryotes）的研究論文。在已有研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步揭示了RUVBL2作為真核生物鐘的共同核心成分，并支持了最初在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)的“緩慢ATP酶活性是生物鐘共同特征”的觀點(diǎn)。
在此前的研究中，張二荃實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)RUVBL2——一種低水解活性的AAA+ ATPase，在哺乳動(dòng)物的生物鐘復(fù)合物（mega-dalton super-complex）中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并調(diào)控晝夜節(jié)律的相位與振幅。然而，由于周期通常被認(rèn)為是衡量晝夜節(jié)律功能更可靠的參數(shù)，而此前的研究缺乏直接證據(jù)表明RUVBL2參與周期調(diào)控，因此RUVBL2是否為核心生物鐘組分仍存在爭議。為了彌補(bǔ)這一缺陷，該研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的高通量篩選技術(shù)，對近1000個(gè)RUVBL2敲入突變體進(jìn)行全面分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在人類U2OS細(xì)胞中，多個(gè)RUVBL2突變體呈現(xiàn)短周期、長周期或無節(jié)律的不同表型。這種通過靶向單一基因即可同時(shí)調(diào)控振幅、相位，并引起雙向周期變化的現(xiàn)象，僅在少數(shù)核心生物鐘基因（例如果蠅的Per和藍(lán)細(xì)菌的kaiC）中被觀察到。此外，RUVBL2的表達(dá)具有節(jié)律性、可被環(huán)境因子調(diào)節(jié)，并且其敲除會(huì)導(dǎo)致無節(jié)律表型，進(jìn)一步證明了RUVBL2是生物鐘的核心成分（圖1）。
圖1.RUVBL2是生物鐘的核心組成成分
（a）在細(xì)胞中敲入突變會(huì)導(dǎo)致長周期、短周期或無節(jié)律的表型，而在小鼠SCN過表達(dá)RUVBL2突變體可重現(xiàn)長周期和短周期的節(jié)律變化。此外，細(xì)胞與小鼠的周期表型呈線性相關(guān)；（b）在小鼠SCN中敲除Ruvbl2會(huì)導(dǎo)致其在恒定黑暗條件下喪失活動(dòng)節(jié)律
為了探究RUVBL2如何影響生物鐘周期，研究團(tuán)隊(duì)對突變位點(diǎn)進(jìn)行了深入分析，發(fā)現(xiàn)這些突變主要集中在P-loop結(jié)構(gòu)域——這一區(qū)域與ATP結(jié)合密切相關(guān)，提示RUVBL2可能通過ATP水解調(diào)控周期振蕩。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，RUVBL2突變體的周期調(diào)節(jié)獨(dú)立于TTFL復(fù)合物中的CRY，即便在CRY蛋白水平下降的情況下，周期表型仍然存在。這一發(fā)現(xiàn)表明RUVBL2可能通過不同于傳統(tǒng)TTFL途徑的方式影響生物鐘周期。
更重要的是，研究人員測定了RUVBL2及其突變體的ATP水解酶活性，結(jié)果顯示RUVBL2水解ATP的速度極慢，每24小時(shí)僅水解13個(gè)ATP分子。這一活性水平遠(yuǎn)低于典型AAA+ ATP酶，但與藍(lán)藻KaiC的ATP水解速率（每天15個(gè)ATP分子）相當(dāng)。這種低活性可能是維持24小時(shí)周期震蕩的基礎(chǔ)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，RUVBL2的ATP酶活性與細(xì)胞周期長度呈顯著負(fù)相關(guān)——較高的ATP酶活性對應(yīng)更短的周期，較低的活性對應(yīng)更長的周期，正如藍(lán)藻的KaiC一樣。結(jié)合結(jié)構(gòu)分析和定點(diǎn)突變，研究人員發(fā)現(xiàn)，與KaiC類似，RUVBL1/RUVBL2晶體結(jié)構(gòu)口袋里的水分子處于不利于對ATP進(jìn)行親核攻擊的位置，導(dǎo)致RUVBL1/RUVBL2的ATP酶活性極低。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步凸顯了RUVBL2與藍(lán)藻KaiC在生物鐘調(diào)節(jié)機(jī)制上的相似性，為揭示真核生物與原核生物生物鐘系統(tǒng)的進(jìn)化關(guān)聯(lián)提供了有力證據(jù)（圖2）。
圖2.在人源RUVBL1/RUVBL2復(fù)合物的ATP結(jié)合口袋中，水分子的位置與藍(lán)藻KaiC相似，都處在一種非優(yōu)化的進(jìn)攻ATPγ-磷酸基團(tuán)的狀態(tài)，因而決定了它們是一類極慢速的ATP水解酶
RUVBL在真核生物中高度保守，其氨基酸序列相似性高達(dá)85%。通過梳理已有文獻(xiàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)RUVBL蛋白廣泛分布于多種生物鐘超復(fù)合物中，表明其可能與不同物種的核心生物鐘成分存在潛在的相互作用。進(jìn)一步結(jié)合免疫共沉淀和質(zhì)譜分析，研究人員證實(shí)了RUVBL2的同源蛋白能夠與哺乳動(dòng)物、果蠅、擬南芥乃至粗糙脈胞菌的核心生物鐘蛋白相互作用。此外，利用遺傳學(xué)操作和藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)RUVBL2在果蠅、擬南芥和粗糙脈胞菌中的同源蛋白也參與晝夜節(jié)律調(diào)控，并且其ATP酶活性與周期長度的關(guān)系與哺乳動(dòng)物和藍(lán)藻一致。這些證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)，RUVBL2作為保守的低活性ATP酶，在調(diào)節(jié)真核生物鐘周期方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
基于這些發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)提出了一個(gè)新的假設(shè)：在遠(yuǎn)古生命起源階段，隨著原始生物鐘的出現(xiàn)，低活性的P-loop ATP酶成為生物鐘系統(tǒng)的核心組件。藍(lán)藻中，KaiC結(jié)合KaiA和KaiB組成了一個(gè)連接到TTFL的強(qiáng)大振蕩器，而在真核生物中，含有P環(huán)的AAA+ ATP酶RUVBL2及其同源蛋白通過與TTFL生物鐘蛋白相互作用，參與生物鐘的調(diào)控。KaiC和RUVBL2極低的ATP酶活性共同決定了生物鐘的24小時(shí)節(jié)律振蕩，這一機(jī)制或許是生物鐘系統(tǒng)進(jìn)化的共同特征。
圖3.藝術(shù)化呈現(xiàn)的生物鐘起源模型
這個(gè)ATP酶驅(qū)動(dòng)的沙漏隱喻了極慢的水解酶動(dòng)力學(xué)決定了振蕩的速度，促成了24小時(shí)的晝夜節(jié)律。背景中組成六聚體的RUVBL2是真菌、果蠅、植物和小鼠生物鐘系統(tǒng)中的共同起源分子。
綜上所述，該研究在之前的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證實(shí)了RUVBL2作為核心生物鐘組分的作用，還揭示了其ATP酶活性如何以類似KaiC的機(jī)制調(diào)節(jié)真核生物的晝夜節(jié)律。這一發(fā)現(xiàn)豐富了真核生物鐘的分子調(diào)節(jié)機(jī)制，并提出了低活性的ATP酶作為生物鐘起源核心組分的進(jìn)化假設(shè)，在進(jìn)化生物學(xué)和生物鐘研究領(lǐng)域具有重要意義。
清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)交叉研究院研究員張二荃為論文的通訊作者。張二荃實(shí)驗(yàn)室的博士生廖媚妹、劉艷琴和徐占聰為論文的共同第一作者。研究得到中國國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、科技創(chuàng)新2030-重大項(xiàng)目、北京市政府、清華大學(xué)及美國國立衛(wèi)生研究院的資助。
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